دانشگاه آزاد اسلامي واحد رشت
پا?ان نامه???????
براي در?افت درجه کارشناس? ارشد در رشته زيست شناسي گرايش ميکروب شناسي???????
عنوان
بررسي مقاومت افزايش يافته به آنتي بيوتيك‌هاي گروه آمينوگليكوزيدي (HLAR) در انتروکوکوس فكاليس با روش كشت و Multiplex-PCR
استاد راهنما:
دکتر نور امير مظفري
استادان مشاور:
دكتر ليلا اسدپور، مهندس هما فروهش تهراني
نگارش:
بهاره رامين
زمستان 1392

صورتجلسه دفاع
با تأييدات خداوند متعال جلسة دفاع از پاياننامه کارشناسي ارشد خانم بهاره رامين در رشتة: ميکروبيولوژي
تحت عنوان: بررسي مقاومت افزايش يافته (HLAR) به آنتي بيوتيك‌هاي گروه آمينوگليكوزيدي در انتروکوکوس فكاليس با روش كشت و Multiplex-PCR
با حضور استاد راهنما، استاد (استادان) مشاور و هيأت داوران در دانشگاه آزاد اسلامي- واحد علوم تحقيقات گيلان در تاريخ —————- تشکيل گرديد.
در اين جلسه، پاياننامه با موفقيت مورد دفاع قرار گرفت.
نامبرده نمرة با امتياز ( بدون احتساب نمره مقاله ) دريافت نمود.
استاد راهنما: دکتر
استاد (استادان مشاور):
1. دکتر
2.
هيأت داوران:
1. دکتر
2.
3.
مدير گروه يا رئيس تحصيلات تکميلي واحد:
معاون پژوهشي و فناوري دانشگاه آزاد اسلامي- واحد رشت
نمره حاصل از ارزشيابي مقاله/ مقالات دانشجو برابر ضوابط ( ازسقف 2نمره ) ………… محاسبه ونمره نهايي پايان نامه ( مجموع نمره دفاع ومقاله ) با درجه ………….. و نمره به عدد ………. به حروف ……………………………………. به تصويب رسيد.
تأييد کارشناس حوزه پژوهشي تأييد معاون پژوهشي و فناوري دانشگاه آزاد اسلامي- واحد رشت
پرديس تحصيلات تکميلي دانشگاه آزاد اسلامي واحد رشت – گيلان
حوزه معاونت پژوهشي
تعهد نامه اصالت رساله يا پايان نامه تحصيلي
اينجانب بهار رامين دانش آموخته مقطع کارشناسي ارشد ناپيوسته / کارشناسي ارشد در رشته زيست شناسي گرايش ميکروبيولوژي که در تاريخ ………….. از پايان نامه / رساله خود تحت عنوان بررسي مقاومت افزايش يافته (HLAR) به آنتي بيوتيك‌هاي گروه آمينوگليكوزيدي در انتروكوكوس فيكاليس با کسب نمره …………. و درجه …………. دفاع نموده ام بدينوسيله متعهد ميشوم :
اين پايان نامه / رساله حاصل تحقيق و پژوهش انجام شده توسط اينجانب بوده و در مواردي که از دستاوردهاي علمي و پژوهشي ديگران ( اعم از پايان نامه، کتاب، مقاله و ….) استفاده نمودهام، مطابق ضوابط و رويه موجود، نام منبع مورد استفاده و ساير مشخصات آنرا در فهرست مربوطه ذکر و درج کردهام.
اين پايان نامه/ رساله قبلا براي دريافت هيچ مدرک تحصيلي ( هم سطح، پايين تر يا بالاتر) در ساير دانشگاهها و موسسات آموزش عالي ارائه نشده است.
چنانچه بعد از فراغت از تحصيل، قصد استفاده و هرگونه بهره برداري اعم از چاپ کتاب، ثبت اختراع و … از اين پايان نامه يا رساله را داشته باشم، از حوزه معاونت پژوهشي واحد، مجوزهاي مربوطه را اخذ نمايم.
چنانچه در هر مقطع زماني خلاف موارد فوق ثابت شود، عواقب ناشي از آن را ميپذيرم و دانشگاه آزاد اسلامي واحد علوم و تحقيقات مجاز است با اينجانب مطابق ضوابط و مقررات رفتار نموده و در صورت ابطال مدرک تحصيليام هيچگونه ادعايي نخواهم داشت.
نام و نام خانوادگي: بهاره رامين تاريخ و امضاء:
0
تقديم به
پدر و مادر عزيز و مهربانم
که در سختي‌ها و دشوار‌ي‌هاي زندگي همواره ياوري دلسوز و فداکار
و پشتيباني محکم و مطمئن برايم بوده‌اند.
همسرم
به پاس قدر داني از قلبي آکنده از عشق و معرفت که محيطي سرشار از سلامت و امنيت و آرامش و آسايش براي من فراهم آورده است
سپاس و ستايش مر خداي را جل و جلاله که آثار قدرت او بر چهره روز روشن، تابان است و انوار حکمت او در دل شب تار، درفشان. آفريدگاري که خويشتن را به ما شناساند و درهاي علم را بر ما گشود و عمري و فرصتي عطا فرمود تا بدان، بنده ضعيف خويش را در طريق علم و معرفت بيازمايد.
فهرست مطالب

عنوان شماره صفحه

چکيده10
فصل اول
کليات12
1- کليات12
1-1- مقدمه12
1-2- بيان مسئله13
1-3- انتروکوک ها14
1-3-1- طبقه بندي14
1-3-2- خصوصيات بيولوژيک ?17
1-3-3- تقسيم‌بندي مولکول?17
1-3-4- شناسا?? انتروکوکوس فکاليس18
1-3-5- فاکتورهاي ويرولانس (بيماري زايي)19
1-3-5-1- مواد تجمع?20?
1-3-5-2- سيتوليزين21
1-3-5-3- ژلاتيناز21
1-3-5-4- فرومون ها22
1-3-5-5- ل?پوت?کوئ?ک اسيد22
1-3-5-6- همول?ز?ن انتروکوكوس فکاليس23?
1-3-5-7- آنت? ژن آندوکارد?ت? انتروکوكوس فکال?س ((EfaA?23?
1-3-5-7-1- پروتئ?ن24
1-3-5-8- ادهسين ک?ژن ? انتروکوكوس فکال?س (ACE)24
1-4- اپيدميولوژي انتروکوکوس فکاليس27
1-5- اهميت باليني28
1-5-1- بيماريزايي:29
1-5-1-1- باکتريمي:29
1-5-1-2- عفونت مجاري ادراري?:32
1-5-1-3- اندوکارديت33
1-5-1-4- عفونت هاي داخل شکم?، لگن? و بافتهاي نرم33
1-5-1-5- سا?رعفونتهاي انتروکوکي35
1-6- درمان36
1-7- مقاومتهاي آنتي بيوتيکي ?37
1-7-1- مقاومت آنها به گل?کوپپت?دها39
1-7-2- مقاومت به آنت? ب?وت?کهاي بتا?کتام40
1-7-3- مقاومت بهآنتي بيوتيکهاي تتراسا?کل?ن41
1-7-4- مقاومت در برابر آنتي بيوتيک هاي ماکروليدي42
1-7-5- ? مقاومت به کلرامفن?کل43
1-7-6- مقاومت به آمينوگليکوزيد ها44
1-7-6-1- تاريخچه روند گسترش مقاومتهاي آمينوگليکوزيدي45
1-7-6-2- انواع مقاومت به آمينوگليکوزيدها46
1-7-6-3- اهميت مقاومت آمينوگليکوزيدي48
1-7-7- مقاومت چند داروئ?42
1-7-8- HLAR و افزايش مرگ و ميز (Mortality)42
1-8- PCR44
1-8-1- Multiplex PCR44
1-8-2- طراحي و اجراي Multiplex PCR45
1-8-3- تيتراسيون اجزاي واکنش:46
1-8-4- شرايط ترموسايکلر:47
1-9- تعريف واژه ها47
فصل دوم
( مباني و تاريخچه)51
2- مروري بر منابع52
فصل سوم
مواد و روش ها62
3- مواد و روش ها62
3-1- نگهداري سو?ه ها:62
3-2- مح?ط هاي کشت مورد استفاده?62
3-3- لوازم و تجهيزات مورد استفاده62
3-4- محلولهاي مورد استفاده و نحوه تهيه آنها64
3-5- آزمايش‌هاي بيوشيميايي66
3-5-1- تست کاتا?ز66
3-5-2- تما?زانتروکوکها از سا?ر استرپتوکوکها67?
3-5-3- کشت بر روي با?ل اسکول?ن آگار67
3-5-4- ? تست تخم?ر قندآراب?نوز67
3-6- رشد در 10 و 45 درجه سانت?گراد?68
3-7- تع??ن الگوي حساس?ت آنت? ب?وت?ک? انتروکوکوس فکاليس68
3-7-1- استاندارد نيم مک فارلند سولفات باريم:70
3-7-2- آماده کردن سوسپانس?ون باکتري :71
3-7-3- روش انجام آزما?ش:71
3-7-4- بررسي مقاومت افزايش يافته به جنتامايسين و استرپتومايسين72
3-7-5- استخراج? DNA?73??
3-7-5-1- استخراج از باکتري کشت داده شده :73
3-7-6- اندازه‌گيري غلظت DNA ژنوميك تخليص شده73
3-7-7- انتخاب و تهيه پرايمر‌هاي مناسب73
3-7-7-1- محلول کار پرايمر PCR73
3-7-8- روش اجرا Multiplex PCR73
3-7-8-1- PCR Amplification:74
3-7-9- آشکارسازي محصولات PCR74
3-7-10- روش انجام الکتروفورز:76
3-8- روش تجزيه و تحليل داده ها:77
3-9- ملاحظات اخلاقي:78
3-10- مشكلات ومحدويت ها:78
3-11- متغير ها:79

فصل چهارم
4- نتايج مطالعه81
4-1- نتايج مربوط به تست بيوشيميايي81
4-2- نتايج مربوط تفکيک جنسيت تمام نمونه ها82
4-3- نتايج مربوط به تفکيک جنسيت تمام نمونه ها82
4-4- نتايج مربوط به تفکيک گروه هاي سني83
4-5- نتايج مربوط به حساسيت آنتي بيوتيکي83
4-5-1- نتايج بررسي مقاومت افزايش يافته به جنتامايسين و استرپتومايسين83
4-6- نتايج مربوط به واکنش زنجيره اي پلي مراز84
4-6-1- استخراج ژنوم87
4-6-2- واکنش PCR90
4-6-3- نتايج مربوط به الکتروفورز محصولات PCR :91
فصل پنجم
بحث و پيشنهادات102
منابع:111
منابع:111
فهرست اشکال
شکل ‏1-1: ساختار فضايي استرپتومايسين36
شکل ‏1-2: ساختار فضايي کانامايسين37
شکل ‏1-3: ساختار فضايي آميکاسين37
شکل ‏1-4: ساختار فضايي جنتامايسين37
شکل ‏4-1: الف) شکل سمت چپ کلوني هاي رشد کرده انتروکوک بر روي بلادآگار را نشان مي دهد. ب) شکل سمت راست محيط کشت بايل اسکولين آگار در شبشه هاي دربسته 5 سي سي مي‌باشد، تيره شدن محيط که نشان دهنده کمپلس آهن و اسکولين مي‌باشد، رشد باکتري را تاييد مي کند.77
شکل 43-2: نتايج تست آرابينوز براي تفکيک سويههاي مورد بررسي از همديگر.78
شکل 4-3 : نتايج حاصل از تفکيک نمونههاي جمع آوري شده بر اساس جنسيت مورد بررسي.78
شکل ‏4-4: نتايج حاصل از تفکيک نمونههاي انتروکوکوس فکاليس در افراد مورد بررسي79
شکل ‏4-5: نتايج حاصل از تفکيک نمونههاي انتروکوکوس فاسيوم در افراد مورد بررسي.79
شکل ‏4-6 نتايج مربوط به گروه هاي سني که در پژوهش حاضر مورد ارزيابي قرار گرفتند.80
شکل ‏4-7: نتايج مربوط به گروه هاي سني نمونه هاي انتروکوکس فکاليس81
شکل ‏4-8: نتايج حاصل از وضعيت گروههاي سني در ارتباط با نمونههاي انتروکوکوس فاسيوم81
شکل ‏4-9 : تعيين حساسيت آنتي بيوتيکي به روش ديسک ديفيوژن. از انتروکوکوس فکاليس ATCC29212 نيز به عنوان کنترل منفي استفاده گرديد82
شکل ‏4-10: از مجموع تمام نمونه هاي انتروکوکوس فکاليس بدست آمده، تعيين حساسيت آنتي بيوتيکي به روش ديسک ديفيوژن صورت پذيرفت. از انتروکوکوس فکاليس ATCC29212 نيز به عنوان کنترل منفي استفاده گرديد82
شکل ‏4-11: مقاومت آنتي بيوتيکي انواع نمونه ها به جنتامايسين84
شکل 4-12: مقاومت آنتي بيوتيکي انواع نمونه ها به استرپتومايسين85

فهرست جداول
جدول ‏4-1: پرايمرهاي استفاده شده در اين مطالعه براي پيدا کردن سويه‌هاي مقاوم به آمينوگليکوزيد69
جدول ‏4-1: نتايج مربوط به جنسيت نمونه هاي مثبت بدست آمده. مشخص شده است.80
جدول ‏4-2: نتايج بررسي مقاومت افزايش يافته به جنتامايسين و استرپتومايسين براي انتروکوکوس فکاليس83
جدول ‏4-3: نتايج بررسي مقاومت افزايش يافته به جنتامايسين و استرپتومايسين براي انتروکوکوس فاسيوم83
چکيده
زمينه وهدف: انتروکوکوس فکاليس و انتروکوکوس فاسيوم با توانمندي بالا در ايجاد بيماريهاي عفوني مانند اندوکارديت، عفونت ادراري و مننژيت هستند. توانمندي بالاي آنها براي کسب ژنهاي مقاومت به آنتي بيوتيک، درمان آنها را با مشکلات جديد مواجه کرده است. هدف از اين مطالعه بررسي مقاومت افزايشي انتروکوکوس فکاليس و فاسيوم به آنتي بيوتيک هاي آمينوگليکوزيدي بوده است.
مواد و روش ها: 100 نمونه انتروکوک از آزمايشگاه باليني نور تهران، پس از جمع آوري با استفاده از تست هاي بيوشيميايي معمول، شناسايي شدند. براي سويه‌هاي جدا شده تست تعيين حساسيت گونهها به آنتي بيوتيکهاي آمينوگليکوزيدي با غلظتهاي افزايش يافته جنتامايسين 120 ميکروگرم و استرپتومايسين 300 ميکروگرم و همين طور ديگر آنتي بيوتيکهاي آمينوگليکوزيدي با استفاده از روش ديسک ديفيوژن انجام شد. در نهايت به منظور شناسايي مولکولي مقاومت، حضور 6 ژن عامل ايجاد مقاومت با استفاده از روش Multiplex PCR بررسي شدند.
نتايج: از 100 ايزوله، 84% انتروکوکوس فکاليس و 16% انتروکوکوس فاسيوم بودند. با روش ديسک ديفيوژن مشخص گرديد 56% از نمونهها به هر دو آنتيبيوتيک جنتامايسين و استرپتومايسين با غلظتهاي افزايش يافته مقاوم بودند. همچنين بيشترين مقاومت به تتراسايکلين مشاهده شد و ژن مقاومت در ايزولههاي ادرار بيش از بقيه نمونهها وجود داشت. در اين مطالعه 18 سويه به ونکومايسين نيز مقاوم بودند. نتايج PCR نشان داد حضور ژنهاي aac(6′)-Ie-aph(2″)-Ia ، ant(4′)-Ia و aph(3′)-IIIa به ترتيب 60% ، 30% و 50% بودند. 9 ايزوله هر سه ژن را داشتند. همچنين ژنهاي aph(2”)-Ib ، aph(2”)-Ic و aph(2”)-Id شناسايي نشدند.
بحث: به دليل وجود مقاومت دارويي در انتروکوک پيشنهاد ميشود از روشهاي مولکولي مانند PCR براي تشخيص سريع و نهايي مقاومت در کنار روشهاي ديسک گزاري استفاده شود. تشخيص درست، سريع و قطعي، تنها راه جلوگيري از افزايش مقاومت به آنتي بيوتيکها و گسترس پديده HLAR است.

کلمات کليدي: انتروکوکوس فکاليس، انتروکوکس فاسيوم، مقاومت آنتي بيوتيکي، آمينوگليکوزيد، MultiplexPCR

فصل اول
کليات
کليات
1-1- مقدمه
انتروکوکها کوکسيهاي گرم مثبتي هستند که اگر چه به طور معمول فلور نرمال دستگاه گوارش انسان و حيوانات محسوب ميشوند، ولي امروزه آنها به عنوان عامل مهم عفونتهاي بيمارستاني مطرح هستند (1). اين باکتريها به علت کسب مقاومتهاي چندگانه به انواع آنتي بيوتيکها، به عنوان يکي از مشکلات درماني محسوب مي‌شوند. از جمله مقاومتهايي که در انتروکوکها ايجاد شده است ميتوان به مقاومت نسبت به دوزهاي بالاي آمينوگليکوزيدها، بتالاکتامها و گليگوپپتيدها اشاره کرد و از آنجائي که معمولاً ونکومايسين به عنوان آخرين راه حل درماني براي سويه‌هاي مقاوم به چند دارو استفاده ميشود (2)، بنابراين مقاومت به ونکومايسين در بين سويه‌هاي انتروکوکي داراي اهميت به سزايي است، مقاومت به آمينو گليکوزيدها نيز به دليل شکست درماني در سينرژي يک داروي موثر بر ديواره باکتري (مثل پني سيلين) و آمينو گليکوزيدها، مشکل ديگري را در درمان آنها ايجاد کرده است (3)، خصوصاً اينکه، اين مقاومتها ميتوانند توسط عناصر ژنتيکي مختلفي مثل ترانسپوزونها و پلاسميدها بين گونههاي انتروکوکي و حتي بين جنسهاي باکتريايي منتقل شوند و در نتيجه طيف وسيعي از باکتريها را درگير کنند (4).
حضور ژنهاي مقاومت برروي کروموزم باکتريايي و يا پلاسميدي ميتوانند مقاومت به چندين آنتيبيوتيک خانواده آمينوگليکوزيدي را ايجاد کند. بنابراين تعيين فراواني ژنهاي مقاومت به آمينو گليکوزيدها ميتواند در انتخاب يک رژيم درماني مناسب، موثر باشد (5).
انتروکوکها که ساليان متوالي، تنها به عنوان فلور غيربيماريزاي دستگاه گوارش انسان و حيوانات محسوب ميشدند، در طول دو دهه گذشته، به سبب نقش موثري که در ايجاد عفونت‌هاي بيمارستاني داشته و استعداد ويژهاي که در کسب مقاومتهاي چندگانه نسبت به انواع آنتي بيوتيکهاي مرسوم نشان داده اند، به شدت مورد توجه قرار گرفتهاند (6, 7).
از انواع مقاومتهايي که نسبت به آنتي بيوتيکهاي مختلف در انتروکوکها مشاهده ميگردد ميتوان به مقاومت نسبت به دوزهاي بالاي آنتي بيوتيکهايي از خانوادههاي بتالاکتامها ( (8)، گليکوپپتيدها (9) و آمينوگليکوزيدها (10) اشاره نمود.
درباره اهميت مقاومت به دوزهاي بالاي آمينوگليکوزيدها کافي است بدانيم درمان عفونتهاي سيستميک چون اندوکارديتها (11)، باکتريمي (12)و مننژيت (13) تنها در حضور رژيمهاي درماني که حاصل ترکيب آنتيبيوتيکي با اين گروه دارويي است، امکان پذير مي‌باشد. آمينو گليکوزيدها به جهت مشاهده مقادير روزافزون مقاومت به دوزهاي بالاي آنها و نقش موثري که عناصر ژنتيکي متحرک خارج کروموزمي همچون پلاسميدها در گسترش اين نوع از مقاومتها بر عهده دارند، از جايگاه ويژهاي برخوردارند (14). امروزه، دستيابي و بکارگيري بهترين، مطمئن ترين و سريعترين روش به منظور تشخيص حضور اين نوع مقاومت، تعيين مقادير MIC1 آنها و نيز يافتن علل انتشار و پراکندگي آنها و در آخر قضاوت پيرامون کارا بودن و يا عدم کارايي اين خانواده آنتي بيوتيکي در رژيمهاي دارويي، از مهمترين وظايف آزمايشگاههاي مرجع، تشخيص طبي و بيمارستانها مي‌باشد.
1-2- بيان مسئله
انتروکوکوس شامل كوكسي گرم مثبت و كاتالاز منفي است، كه تا كنون 19 گونه آن شناسايي شده‌اند. اما فقط 2 گونه از آن يعني انتروکوکوس فکاليس وانتروکوکوس فاسيوم عامل اصلي در عفونتهاي انساني مي‌باشند. اين دو گونه يکي ازشايعترين عوامل عفونتهاي بيمارستاني نيز محسوب ميشوند كه اطلاق نام انتروکوک به دليل توانايي حضور آنها در روده ميباشد و در ضمن اين گروه يکي از مقاومترين گروه باکتريها در مقابل آنتي بيوتيکها ميباشند (15).
يکي از دلايل اصلي نقش آنها در عفونت بيمارستاني مقاومت ذاتي اين باکتري به چندين آنتي بيوتيك مورد بيمارستان ديده استفاده مي‌باشد و مهم‌تر اينكه شايد توانايي آنها براي دريافت مقاومت به تمام آنتي‌بيوتيك‌ها به دليل قدرت دريافت اجزاي خارجي ژنتيکي ازطريق پلاسميد است. همچنين ايجاد مقاومت ميتواند از طريق موتاسيون صورت گيرد؛ که منجر به ايجادانتروکوکهاي مقاوم به وانکومايسين مي شود. کنترل اين دسته بسيار مشکل شده است (16, 17)

روش‌هاي كشت به 24 تا 48 ساعت زمان نياز دارد، تا باكتري رشد كرده و تعيين هويت شده و آزمايش تعيين حساسيت براي آن انجام شود(18). در بعضي از موارد سرعت عمل مي‌تواند جان بيمار را نجات دهد، لذا استفاده از روش مولكولي مولتي پلکس PCR جهت تشخيص باكتري‌هاي عامل عفونت مي‌تواند مفيد باشد (19, 20).
1-3- انتروکوکها2
1-3-1- طبقه بندي
واژه انتروکوك توسط ت? ?ر س?ل?ن 3 درسال 1899 براي توص?ف ارگان?سم هاي کوچک?4 که به صورت جفت ?ا زنج?رههاي کوتاه در مدفوع د?ده شدند، انتخاب شد. مشاهدات اول?ه در مورد خصوص?ات رنگ آم?زي گرم، شکل، آرا?ش سلول? و فقدان کاتا?ز، انتروکوك ها را به? عنوان اعضاء جنس استرپتوکوك معرف? نمود. با گسترش س?ستم گروه بندي ?نسف?لد5 در سال 1933، انتروکوکها از نظر آنت? ژن اختصاص? در گروه D?قرار گرفتند (21). ربکا لانسفيلد رده بندي جديدي را پيشنهاد کرد. وي دريافت که اگر استرپتوکوک را در محيط کشت مايع با اسيديته قوي ( pH=2) قرار داده و به مدت 10 دقيقه در گرماي C0 100 نگه دارند ماده آنتي ژن محلولي از جنس هيدرات کربن از ديواره باکتري خارج مي شود که آن را، کربوهيدرات C ناميد، و بر اساس اين آنتي ژن آنها را به گروه هاي A تا E تقسيم بندي کرد. تمام اعضاي جنس انتروکوک با آنتي سرم گروه D لانسفيلد واکنش ميدهند (22, 23(.
در سال 1906 نام انتروکوکوس فکاليس? توسط اندرو و هوردر6 براي ارگان?سم? با منشأ مدفوع? که توانا?? انعقاد ش?ر، تخم?ر مانت?ول و ?کتوز و عدم توانايي تخم?ر راف?نوز را داشت بکار برده شد (23(.
جنسون7، انتروکوکوس فاس?وم را که از نظر الگوي تخم?ري متما?ز از نتروکوکوس فکال?س بود را شرح داد (24, 25(.
استرپتوکوکوس دورانس8 توسط و وينگ که مشابه با استرپتوکوکوس فاسيوم با فعاليت تخميري کمتر معرفي گرديد، اما جنسن انتروکوکوس نخستين بار در سال 1984 توسط چليپر و کليفر ا از استرپتوکوکوها جدا شد. جنسن انتروکوک فقط داراي آنتي ژن گروه D است که جزء فلور نرمال دسگاه گوارش انسان ميباشد. ساير گونهها که آنتيژن گروه D را دارند قسمتي از فلور نرمال روده را تشکيل ميدهند و استرپتوکوکهاي گروه D ميباشند (26، 27)
امروزه اما اين جنس، گونه‌هاي متعددي را در خود جاي مي‌دهد که تعداد آنها در منابع مختلف از 17 تا 21 گونه متغير بوده (23, 26) و در 5 گروه قرار مي‌گيرند (26) . شايع‌ترين آنها دو گونه، E. faecium وE. faecalis هستند. اما گزارش‌هايي به ندرت مبني بر مشاهده ساير گونه‌ها در عفونت‌هاي انساني ديده شده است که از انواع اين‌گونه‌ها مي‌توان به E.durans، E. flavescens, E. munstii, E. gallinarum, E. avium, E. casseliflavus, E. raffinosus و E.hirae اشاره نمود (22, 26, 27). حضور اين‌گونه‌ها در مناطق مختلف دنيا متفاوت بوده است. به عنوان مثال در مواردي دو گونه E. gallinarum , E. casseliflavus. غالب‌ ترين انواع پس از E. faecalis وE. faecium گزارش شده است (28).
1-3-2- خصوصيات بيولوژيک ?
انتروکوکها، گرم مثبت ب?هوازي اخت?اري و کاتا?ز منف? هستند قادرند? در مح?ط حاوي 5/6% کلريد سديم، 40 % صفرا رشد ميکنند. آنها معمولاً در pH محدوده ( 6 الي 9) و در دماي C0 45-10رشد مي‌کنند. انتروکوکها در C0 60، 30 دقيقه زنده ميمانند. اما رشد بهينه آنها در C0 37مشاهده مي‌گردد. اين باکتري‌ها همچنين توانايي رشد در NaCI 6.5%, pH=9.6 و نمکهاي صفراوي را داشته و اغلب آنها قادر به هيدروليز پيروات مي‌باشند (29, 30). اعضاي اين گروه به راحتي قادر به رشد بر روي محيط (Blood Agar) BA بوده و غالباً قادر به ليز گبلولهاي قرمز نميباشند (هموليز ?) اما انواع آلفا (?) و بتا (?) نيز در ميان آنها مشاهده مي‌گردد (31). به طوري که نوع ? در ميان 10 گونه از انواع انتروکوکها ديده مي‌شود. اين باکتري‌ها قادرند به راحتي شرايط سخت محيطي را تحمل کنند (32). لذا هر جايي در طبيعت، از جمله خاک، غذا، آب، حيوانات، پرندگان و حشرات قابل جداسازي هستند (33).????????????????
انتروکوکها، کموارگانوتروف9 با متابوليسم جور تخمير بوده و دامنه وسيعي از کربوهيدرات‌ها را تخمير مي‌کنند که محصول عمده اين فرايند اسيدلاکتيک است و هيچ گازي توليد نمي‌گردد.
اين باکتريها فاقد آنزيمهاي سيتوکروم هستند، اما گاهي اوقات توليد کاتالاز کاذب ميکنند . تقريباً همه سويه‌ها هموفرمانتات?و10 بوده و از تخم?ر گلوکز، اسيدلاکتيک تول?د? مي‌کنند. آنت? ژن ،D? ?ک گل?سرول ت?کوئ?ک اس?د مرتبط با ديواره سلولي است کهدرهمه سويهها وجود دارد. درصد گوان?ن + سيتوز?ن آنها 37-45 درصد مي‌باشد (34). ????????????????
1-3-3- تقسيم‌بندي مولکول?
بر اساس توالي 16SrRNA گونههاي انتروکوک در چندين گروه قرار گرفته اند(35)
???
1. گروه انتروکوکوس فکال?س11: شامل انتروکوکوس فکال?س، هموپراکس?داز و موراونس?س.??
2. گروه انتروکوكوس فاس?وم12: شامل انتروکوكوس فاس?وم، دورانس، ه?ره، موندت?، پورک?نز و? و?لوروم.??
3. گروه انتروکوكوس آو?وم13: شامل انتروکوكوس آو?وم، پسودواو?وم، مالودوراتوس وراف?نوزوس .?
4. گروه انتروکوكوس کاسل? ف?ووس14: شامل انتروکوكوس کاسل? ف?ووس، گال?ناروم، ف?وونس??
5. گروه انتروکوكوس سکوروم15: شامل انتروکوكوس سکوروم و کلومبا.??
6. گروه انتروکوكوس د?سپار16: شامل انتروکوكوس د?سپار و اس?ن?.??
7. گروه ساکارول?ت?کوس17: شامل انتروکوكوسساکارول?ت?کوس، سولفوروس??

1-3-4- شناسا?? انتروکوکوس فکاليس
گونههاي انتروکوك را بر اساس توانا?? تشک?ل اس?د در مح?ط حاوي مان?تول و سوربوز? براث و ه?درول?زآرژ?ن?ن به پنج گروه تقسيم‌بندي کرده‌اند (35).
گروه اول توانا?? تشک?ل اس?د در مح?ط مان?تول براث و ه?درول?ز آرژ?ن?ن را داشته اما? سوربوز منف? مي‌باشند. انتروکوکوس فکاليس در اين دسته قرار مي‌گيرد. اين‌گونه مسئول 90-85 % عفونت‌هاي انتروکوک? انسان است. ع?وه بر? روده انسان، در دستگاه گوارش مرغ، گوساله، خوك، اسب، گوسفند و بز ن?ز ?افت مي‌شود. وجه? تما?ز آن از د?گر اعضا گروه 2، منف? بودن تست آراب?نوز است. تعدادي از وار?انتهاي آن قادر? به تحمل تلور?ت و استفاده از پ?رووات مي‌باشند.?
گروه دوم توانا?? تشک?ل اس?د در مح?ط حاوي مان?تول و سوربوز براث را داشته اما فاقد? توانا?? ه?درول?ز آرژ?ن?ن مي‌باشند.
گروه سوم آرژ?ن?ن را ه?درول?ز کرده اما در مح?ط مانت?ول براث و سوربوز اس?د? تشک?ل نمي‌دهند. – واريانتهاي مان?تول منف? انتروکوكوس فکال?س در اين گروه قرار دارند. در وار?انتهاي غ?ر شا?ع? انتروکوکوس فکال?س که مان?تول منف? و پ?روات مثبت مي‌باشند، آراب?نوز، راف?نوز و سوکروز? منف? مي‌باشد. انتروکوكوس فاس?وم مان?تول منف? نيز تنها عضو ا?ن گروه است که قادر به استفاده از? آراب?نوز مي‌باشد.?
گروه چهارم متشکل از 3 گونه مي‌باشد که از نظر تشک?ل اس?د در مح?ط حاوي سوربوز و? مانت?ول براث مثبت بوده و ه?درول?ز آرژ?ن?ن آن منف? مي‌باشد. هيچ‌کدام از زير گونه هاي انتروکوکوس فکاليس در اين گروه قرار ندارد.
گروه پنجم، شامل گونه هاي انتروکوکوس کاسل? ف?ووس?18 ، انتروکوکوس گال?ناروم19?، انتروکوکوس فکال?س?، انتروکوکوس کولومبا20 در اين گروه هستند. البته انتروکوکوس کولومبا مشابه وار?انتهاي آرژ?ن?ن منف? انتروکوکوس فکال?س? مي‌باشد و با تشک?ل اس?د در را مح?ط راف?نوز براث از انتروکوکوس فکال?س متما?ز مي‌شود.

1-3-5- فاکتورهاي ويرولانس (بيماري زايي)
گرچه مقاومت‌هاي آنتي بيوتيکي در تبديل انتروکوکها به يکي از عوامل مهم عفونت‌هاي بيمارستاني نقش مهمي دارند، اما اين مقاومتها در کنار فاکتورهاي ويرولانس ذاتي، با هم بصورت مستقل در ايجاد بيماري نقش دارند (36). ميتوان گفت حضور همين فاکتورهاي ويرولانس است، که با وجود حساسيت بيشتر انتروکوکوس فکال?س در مقايسه با انتروکوکوس فاسيوم نسبت به آنتي بيوتيکها، آنها را به گونه غالب در ايجاد عفونت‌هاي انتروکوکي تبديل کرده است (37)
انتروکوکوس فکاليس حامل فاکتورهاي ويرولانس متعددي همچون سيتوليزين، محصولات سوپر اکسيد خارج سلولي21، انتقال پلاسميدهاي حساس به فرمون22 ويک پروتئين سطحي متصل شونده، از انواع ESP23 (Entrococcal surface protein) ، که به تازگي شناسايي‌شده و به منظور کلونيزه نمودن موفقيت‌آميز بيماران ضروري مي‌باشند. سه مورد ESP، سيتوليزين و مواد تجمعي، تقريباً تنها ويژه انتروکوکوس فکاليس است (37). جز در موارد نادري که ESP در انتروکوکوس فاسيوم هاي مقاوم به آمپي‌سيلين مشاهده شده است.
1-3-5-1- مواد تجمع?24????????????????????
در سويه‌هاي خاص? از انتروکوکها در پاسخ به فرمونهاي توليدشده? توسط سا?ر انتروکوکها فرمون سرم ا?جاد مي‌شود. مواد تجمع? سبب اتصال ا?ن ارگان?سمها به? سلول‌هاي توبو?ر کل?وي شده و در گسترش عفونت ادراري نقش مهمي بازي مي‌کنند (38)، همين طور سبب اتصال سلول? باکتري دهنده و گ?رنده براي انتقال پ?سم?د مي‌گردند(39). بع?وه ا?ن مواد در زنده ماندن انتروکوکوس فکال?س در 25PMN?ها به دنبال فاگوست?وز نقش دارند (40). و موجب انترناليزه شدن انتروکوکها از طريق سلول‌هاي اپي تليال روده مي‌شوند (41). ?
جهت افزا?ش و?رو?نس، مواد تجمع? و س?تول?ز?ن به طور همافزايي از طر?ق مدل
Quarom – sensing ? با تنظ?م ترشح س?تو??ز?ن منجر به آس?ب بافت? ب?شتر در موارد? اندوکارد?ت مي‌گردند.?

1-3-5-2- سيتوليزين26
حضور سيتوليزين که تظاهر آن به صورت ليز گلبولهاي قرمز در محيط کشت مي‌باشد، تقريباً در 60% سويه‌هاي انتروکوکوس فکاليس مشاهده شده است. اين فاکتور ميتواند توسط پلاسميدها انتقال يافته و به کروموزوم باکتريايي داخل گردد. حضور هموليزين ميتواند در سطح محيطهاي حاوي 50% خون انسان يا اسب بررسي گردد. شايان ذکر است که روي اگار خون دار که حاوي خون گوسفند مي‌باشد، سه‌به‌دو صورت نمي‌گيرد (42, 43).
آزمايش‌ها نشان مي‌دهد که حضور اين فاکتور ويرولانس در سويه‌هاي مولد باکتريمي، سبب افزايش مرگ‌ومير تا 5 برابر مي‌گرد (42). از سيتوليزين انتروکوکوس فکاليس، به عنوان يک توکسين منحصربه ‌فرد باکتريايي ياد مي‌گردد (44). قبلاً نيز اشاره نموديم که حضور هموليزين در سويه‌هاي HLGR، وضعيت بيمار را حادتر ميکند (45). به عنوان مثال در آزموني که در دهه 1980 توسط Jett و همکارانش انجام شد، معلوم گرديد که ميزان خطر در اين سويه ها 5 برابر سويه‌هاي فاقد هموليزين است. پس از آن کابالرو گرندو27 و همکاران دريافتند که حساسيت يا مقاومت اين سويه ها به جنتامايسين(به تنهايي) تاثيري در شدت بيماري ندارد و اين فاکتور هموليزين است که در افزايش حدت نقش دارد (36).

1-3-5-3- ژلاتيناز28
ژلاتيناز29 نيز مانند هموليزين، ازانواع فاکتورهاي ترشحي است که نقش مهمي در حدت بخشيدن عفونتها و بيماريهاي انتروکوکي دارد (47).
دوپونت و همکاران نشان دادند که ژلاتيناز و توليد آن در سويه‌هاي انتروکوکي باعث کاهش مقدار LD5030 براي موشهاي آزمايشگاهي مي‌گردد (48). نتايج نشان مي‌دهد بيش از 50% انتروکوک هاي مولد اندوکارديت و 27% از سويه‌هاي جدا شده از مدفوع بيماران، مولد اين فاکتور ميباشند.

1-3-5-4- فرومون ها31
پپت?دهاي کوچک? هستند (8-7 اس?د آم?نه) که توسط انتروکوکوس فکال?س براي افزا?ش انتقال پ?سم?د از طريق Conjugation در ب?ن سو?ه ها ترشح مي‌گردند. ا?ن? پپت?دها از طر?ق کروموزوم کد م? شوند. ع?وه بر فرمون ها هر پ?سم?د پاسخ دهنده به? فرمون ?ک پپت?د ترشح? را کد م?کند که به عنوان ?ک مهار کننده رقابت? براي فرمون در نظر گرفته ميشود (49). تحق?قات اخ?ر نشان دادهاند که برخ? از فرمونها به عنوان مهار کنندههاي? خودشان عمل ميکنند. مهار?کننده ها?شان قادر به جذب ش?م?ا?? نوتروف?لها همراه با ترشح آنزيمهايگرانول? والقاء? انفجار تنفس? هستند (50).

1-3-5-5- ل?پوت?کوئ?ک اسيد32
از د?گر عوامل موثردر بيماريزايي مي‌باشند که? خصوص?ات ب?ولوژ?ک متعددي براي آنها شناسا?? شده است. مشخص شده که اس?د? ل?پوت?کوئ?ک انتروکوکي به طور قابل برگشت? به اريتروسيتهاي انسان? متصل مي‌شود.? تحق?قات نشان دادهاست که اس?دهاي ل?پوت?کوئ?ک انتروکوک، آزاد سازي ا?نترلوک?ن شش و? فاکتور بتا ?ک نکروز دهنده توموري آلفا را از منوس?تهاي انسان? القاء مي نمايد (51).? ????????????
1-3-5-6- همول?ز?ن انتروکوكوس فکاليس????????
درصد ز?ادي از ا?زولههاي? کل?ن?ک? انتروکوكوس فکال?س قادر به تول?د هموليزين به عنوان يک پروتئ?ن س?تول?ت?ک هستند و اريتروسيتهاي انسان، خرگوش و اسب را ل?ز کرده ول? روي اريتروسيتهاي گوسفند تاث?ري ندارند (31, 52) ???????????????????
فنوت?پ س?تول?ز?ن معمولاً توسط پ?سم?دهاي قابل انتقال کد مي‌گردد ول? گاه?? ژنهاي س?تو??ز?ن در عناصر کرموزوم? د?ده م?شوند (31).???????????????????
PADa، پ?سم?د کد کننده همول?ز?ن نام دارد. همول?ز?ن انتروکوکها خاص?ت? ? باکتريوسيتي داشته و گونههاي باکتر?ا?? گرم مثبت را به م?زان وس?ع? مهار م?کند (53). فرم فعال س?تول?ز?ن متشکل از دو ز?رواحد پپت?دي غ?ر مشابه مي‌باشد که هردوي آنها? جهت فعال?ت همول?تک و باکتر?س?دال ضروري مي‌باشند (54). ???????????????????????????????
1-3-5-7- آنت?ژن آندوکارد?ت? انتروکوكوس فکال?س ((EfaA33?
آنت? ژن 73 کيلو دالتوني efaA?از سويه‌هاي انتروکوکوس فکال?س ايجادکننده اندوکارد?ت? جدا شده است (31). ? از پروب efaA?جهت شناسا?? گونه هاي انتروکوكوس فکال?س استفاده مي‌گردد (55)، با? ا?ن حال نقش efaA ?در ب?مار?زا?? عفونت‌هاي انتروکوکوس هنوز مشخص نشده است. (11) ?????

1-3-5-7-1- پروتئ?ن سطح? انتروکوکي34 (ESP)
ژن esp?همراه با اپرون س?تول?ز?ن بر روي کروموزوم? به طول 150 ک?لوبازي که شباهت? به جزا?ر پاتوژن?سته باکتري‌هاي گرم منف? است قرار دارد پروتئ?نesp به عنوان ادهسين?انتروکوكوس فکال?س در کلون?زاس?ون دستگاه ادراري و تشک?ل ب?وف?لم نقش دارد (56)? ژن esp از 41% اکنتروکوک فکاليسها با منشا خوني، 42% اندوکارد?ت و 3% مدفوع جدا شده است (57).

1-3-5-8- ادهسين ک?ژن ? انتروکوكوس فکال?س35 (ACE)
ادهسين ?ک ک?ژن باند شونده در سويه‌هاي انتروکوكوس فکاليس ب?مار?زا و همز?ست مي‌باشد.? اين پروتئين در ط? عفونت انسان? در انتروکوك ب?ان مي‌گردد. توسط ا?ن مولکول چسبنده سويه‌هاي انتروکوکوس فکال?س به ک?ژن ت?پ 1 و 4، ?م?ن?ن و و?ترونکت?ن متصل مي‌گردند. ا?ن ادهسين متشکل از? يک سکانس n ترم?نال با 31 اس?د آم?نه، بخش (a?متصل به ک?ژن) با 335 اس?د? آمينه، بخش b از واحد هاي تکراري 47 اس?د آم?نه اي و بخش غن? از پرول?ن متصل به د?واره سلولي و ناحيه 8 آمينواسيدي متصل به غشا ست?وپ?سم? در بخش انتهاي کوبوکس?ل قرار?دارد (58, 59).????????????????
موراري و همکارانش نشان دادند که در تمام ا?زولههاي کل?ن?ک? انتروکوك ژن ace وجود دارد و از آن ميتوان در شناسايي به روشهاي مولکولي استفاده کرد (60, 61)
1-4- اپيدميولوژي انتروکوکوس فکاليس
ساليان متمادي، انتروکوکها به عنوان فلور بي خطر و غيربيماريزا و با پتانسيل کم در ايجاد عفونت هاي انساني شناخته ميشدند. اين باکتريها به عنوان فلور نرمال مجاري رودهاي در %95 افراد سالم، مشاهده شده و به صورت غير بيماريزا در دستگاه ادراري- تناسلي ، ناحيه پيرينه36 (62) حفره دهاني ، مجاري کبدي- صفراوي، مجاري تنفسي فوقاني و ساير بخش هاي بدن انسان وجود دارند. (63, 64)
بيماريزايي اعضاي اين جنس، نخستين بار در اواخر قرن نوزدهم ميلادي و توسط مک هالوم و کاستينگ37 مورد بررسي قرار گرفت و اين ارگانيسم را از يک مورد اندوکارديت حاد جدا نمودند (61).
انتروکوکها به صورت فزايندهاي در طي دو دهه گذشته و در قالب پاتوژنهاي بيمارستاني مورد توجه قرار گرفته اند که از دلايل آن ميتوان به گسترش روزافزون انتروکوکهاي مقاوم به عوامل ضدميکروبي اشاره نمود (64-66)
به علاوه انتروکوکها را به عنوان باکتريهاي بي هوازي اختياري، ميتوان در عفونتها و آسيبهاي جلدي در کنار باکتريهاي هوازي همچون اشريشيا کولي38 و باکتريهاي بيهوازي مانند باکتريوئيدس فراژيليس 39مشاهده نمود (67, 68) که به اين ترتيب نقش مهمي در عفونت‌هاي مخلوط باکتريايي ايفاء مينمايند. عفونت‌هاي انتروکوکي اغلب در مجاري ادراري، آبسه هاي درون شکمي و خون يافت مي‌شوند که در اين ميان، مجاري اداري، منبع رايج انتروکوک مي‌باشد و اندوکارديت، مننژيت و عفونت‌هاي تنفسي، موارد کمتري را به خود اختصاص ميدهند. اين باکتريها به عنوان دومين عامل عفونتهاي بيمارستاني (12%)، دومين عامل زخمهاي جراحي (13%) و مجاري اداري (16%) و سومين عامل باکتريمي(8%) در آمريکا شناخته شده اند(69-72). در ميان اعضاي اين جنس دو گونه انتروکوکوس فاسيوم40 و انتروکوکوس فکاليس41 به ترتيب (90-80)% و (10-5)% عفونتها را به خود اختصاص ميدهند (6, 73, 74). از آنجا که اين باکتريها به راحتي، به صورت مستقيم و غيرمستقيم، قابل انتقال هستند، کنترل و مراقبتهاي مداوم به منظور جلوگيري از گسترش آنها ضروري مي‌باشد. اما اين نقل و انتقالات زماني اهميت بيشتري مييابد که شواهدي از مقاومتهاي آنتي بيوتيکي در سويه‌هاي مزبور مشاهده گردد به خصوص اگر اين مقاومتها از نوع مقاومتهاي چندگانه دارويي (MDR) باشد. که بحث پيرامون ايپدميولوژي اين دسته از سويه ها طي دو دهه گذشته به شدت افزايش يافته است(75). تا آنجا که ازعفونتهاي مزبور به عنوان super infection”” ياد مي‌کنند و معمولاً در افرادي مشاهده مي گردد که به تازگي تحت درمانهاي آنتي بيوتيکي قرار گرفته اند(73, 76, 77).
درمان با آنتي بيوتيک ها احتمال افزايش کلونيزاسيون با ارگانيسمهاي مقاوم به دارو را افزايش مي دهد که به اين ترتيب ، مقاومتهاي آنتي بيوتيکي در کنار فاکتورهاي ويرولانس ذاتي، هر دو در ايجاد بيماري (با هم اما به صورت مستقل) عمل مي‌کنند (78). اهميت سويه‌هاي انتروکوک با ويژگيMDR نه تنها به دليل افزايش درصد بيماريزايي42 و مرگ و مير 43بوده، بلکه به دليل هزينه هاي گزافي است که اين سويهها به سيستم درماني تحميل مي‌کنند. همچنين باعث مي‌شوند که آنتي بيوتيکهايي همچون بتالاکتامها، آمينوگليکوزيدها و گليکوپپتيدها که زماني به عنوان راه درماني موثر در عفونت‌هاي انتروکوکي قلمداد ميشدند، اکنون اثر بخشي خود را از دست بدهند (8, 65, 79).
نتيجه آنکه در حال حاضر، درمان انتروکوکهاي مقاوم به انواع آنتي بيوتيکها معضلي است که توجه پزشکان، داروسازان، و ساير متخصصين را به خود جلب نموده است و از اوايل دهه 1990 ميلادي، استعداد بالقوه بيماريزايي اعضاي اين جنس، بخصوص گونه انتروکوکوس فاسيوم و کنترل آنها، مطالعات فراواني را به خود اختصاص داده است.
1-5- اهميت باليني
1-5-1- بيماريزايي:
براي ايجاد عفونت، انتروکوکها بايستي ابتدا توانايي کلونيزاسيون در سطوح مخاطي را داشته باشند و پس از فرار از سيستم دفاعي ميزبان نهايتاً با توليد تغييرات پاتولوژي در ميزبان عفونت را به وجود آوردند. انتروکوکها به طور نرمال در دستگاه گوارشي انسان کلونيزه مي‌شوند و حرکات طبيعي دستگاه گوارش را از بين ميبرند (80). در اينجا به اختصار برخي از عفونت هاي



قیمت: تومان


پاسخ دهید