دانلود پایان نامه

دانلود متن کامل پایان نامه مقطع کارشناسی ارشد رشته زیست شناسی

گرایش : علوم سلولی و مولکولی

عنوان : مطالعه اثر مایعات یونی بر پایداری و فعالیت هیدرولازی آنزیم لیپاز ترموانروباکتر ترموهیدروسولفوریکوس

دانشگاه شیراز

دانشکده علوم

 

پایان­  نامه کارشناسی ارشد در رشته زیست شناسی(علوم سلولی و مولکولی)

 

مطالعه اثر مایعات یونی بر پایداری و فعالیت هیدرولازی آنزیم لیپاز ترموانروباکتر ترموهیدروسولفوریکوس

 

 

استاد راهنما:

دکتر حمیدرضا کربلایی حیدری

 

دی ماه 1393

(در فایل دانلودی نام نویسنده موجود است)

تکه هایی از متن پایان نامه به عنوان نمونه :

(ممکن است هنگام انتقال از فایل اصلی به داخل سایت بعضی متون به هم بریزد یا بعضی نمادها و اشکال درج نشود ولی در فایل دانلودی همه چیز مرتب و کامل است)

چکیده

مایعات یونی را می­توان به عنوان محیط واکنش­های بیوکاتالیز جایگزین­هایی سبز برای حلال­های آلی به شمار برد. ترکیبات مختلفی از کاتیون­ها و آنیون­ها را می­توان جهت دست­یابی به طیف وسیعی از مایعات یونی با ویژگی­های فیزیکی شیمیایی مختلف به کار برد. با توجه به گستره وسیع خصوصیات مایعات یونی، نیاز است که مایعات یونی مناسب برای هر آنزیم خاص و هر محیط واکنش خاص مشخص شود. آنزیم لیپاز ترموانروباکتر ترموهیدروسولفوریکوس (TTL) یک لیپاز مقاوم به دما است که اختصاصیت انانتیومری خوبی نسبت به الکل­های ثانویه دارد. بنابراین از TTL می­توان به عنوان یک آنزیم بالقوه صنعتی، در انجام واکنش های تفکیک مخلوط­های راسمیک استفاده کرد. در این پژوهش فعالیت هیدرولازی آنزیم TTL در حضور غلظت­های مختلف مایعات یونی [CnMIM][Br] (12، 6، 4، 2 = n) مورد بررسی قرار گرفت. با توجه به این موضوع که پایداری دمایی آنزیم در محیط­های حاوی مایعات یونی یک شرط مهم برای استفاده از این محیط­ها در فرآیندهای صنعتی می­باشد، پایداری دمایی آنزیم از نظر سینتیکی و ساختاری در 10 نوع مایع یونی با کاتیون­ها و آنیون­های مختلف مورد بررسی قرار گرفت. نتایج افزایش فعالیت هیدرولازی و پایداری دمایی آنزیم TTL در مایعات یونی نسبت به محیط بافری را نشان می­دهد. غلظت بهینه مایعات یونی [CnMIM][Br] در جهت افزایش فعالیت آنزیمی نیز به دست آمد. نتایج نشان داد که آنزیم TTL به ترتیب در غلظت های 3/0، 1 و 3/0 مولار از مایعات یونی [C2MIM][Br]، [C4MIM][Br] و [C6MIM][Br] بهترین فعالیت را داشته است. در حالی­که در مورد مایع یونی [C12MIM][Br] هیچ اثر مثبتی بر فعالیت هیدرولازی آنزیم مشاهده نشد. همچنین مشخص گردید که نوع کاتیون و نوع آنیون مایعات یونی، شدت اثر آن­ها بر پایداری آنزیم TTL را تحت تأثیر قرار می­دهد. نوع آنیون به دلیل اندازه کوچک و چگالی بار بالایی که دارند، اهمیت بیشتری نسبت به نوع کاتیون دارد. در مقایسه­ای که بین مایعات یونی [C4MIM][PF6] و [C4MIM][Br] در دماهای بالا (°C 85 و °C 90) انجام شد، مایع یونی دارای آنیون PF6 اثر پایدارکننده بیش­تری را برای آنزیم TTL ایجاد کرد. پایداری آنزیم در حضور مایعات یونی با طول زنجیره آلکیلی کوتاه و متوسط، مشابه بود. هرچند مایعات یونی با زنجیره کاتیونی طویل اثر منفی بر پایداری ساختار آنزیم می­گذارند. همچنین در این پژوهش نشان داده شد با تغییر نوع کاتیون از پایه ایمیدازولیوم به پایه پیریدینیوم تغییر زیادی در میزان پایداری دیده نمی­ شود. مطالعات ساختاری پایداری دمایی آنزیم پس از حرارت­دهی در °C 85، با روش اسپکتروسکوپی فلورسانس نیز انجام شد. مطالعه فلورسانس ذاتی TTL نشان داد که در مایعات یونی با آنیون PF6 ساختار آنزیم تا حد زیادی حفظ می­شود؛ به طوری که تفاوت کمی بین شدت نشر فلورسانس قبل و بعد از 1 ساعت حرارت­دهی در °C 85 دیده می­شود. در مایعات یونی [C4MIM][Br] و [C4MIM][PF6] بعد از 45 دقیقه آنزیم همچنان بیش از 50 % از فعالیت خود را حفظ کرد. این درحالی است که پایداری آنزیم در محیط آبی در دماهای بالاتر از °C 80 کمتر از 15 دقیقه است. با توجه به یافته های پژوهش حاضر، می توان از آنزیم TTL برای کاتالیز فرایند­های زیستی در مایعات یونی و دماهای بالا بهره برد.

کلمات کلیدی: مایعات یونی، لیپاز، ترموانروباکتر ترموهیدروسولفوریکوس ، پایداری دمایی.

 

 

 

فهرست مطالب

 

 

عنوان صفحه
فصل اول: مقدمه

 

 
1-1- آنزیم­ها 2
1-2- لیپازها 3
1-2-1- ارتباط ساختار آنزیم لیپاز با عملکرد آن 5
1-3- آنزیم­ها در محیط آلی 6
1-4- مایعات یونی 8
1-5- بیوکاتالیز در مایعات یونی 9
1-5-1- آنزیم­ها در مخلوط­های مایع یونی – آب 10
1-5-2- فعالیت آنزیم­ها در شرایط نسبتا بی­آب در مایعات یونی 11
1-5-3- پایداری آنزیم­ها در مایعات یونی تقریبا بی­آب 13
1-5-4- آنزیم­ها، مایعات یونی، پیوندهای هیدروژنی و فعالیت 13
1-5-5- بیوترانسفورماسیون در محیط مایعات یونی توسط لیپاز­ها و استرازها 14
1-6- بررسی ساختار پروتئین به روش اسپکتروسکوپی فلورسانس 15
فصل دوم: بر پژوهش­های پیشین

 

 

 

2-1- پیشینه کاربرد مایعات یونی در بیوکاتالیز 18
2-2- اثر مایعات یونی مختلف بر فعالیت و پایداری آنزیم 19
2-3- بررسی ساختار آنزیم­ها در مایعات یونی 22
اهداف 23
فرضیه 23
فصل سوم: مواد و روش­ها

 

 

 

3-1- ابزار 25
 

عنوان

صفحه
3-2- مواد 26
3-2-1- مواد لازم جهت تهیه مایعات یونی 26
3-2-2- مواد لازم جهت تهیه آنزیم لیپاز درون سلولی TTL 26
3-2-2-1- سوش باکتری 26
3-2-2-2- مواد مورد نیاز برای ترانسفورماسیون 26
3-2-2-3- مواد مورد نیاز برای کشت باکتری و استخراج عصاره سلولی 26
3-2-2-4- مواد مورد نیاز برای تخلیص آنزیم لیپاز 26
3-2-2-5- مواد مورد نیاز برای سنجش کمی میزان پروتئین و ژل SDS PAGE 27
3-2-3- مواد مورد نیاز برای سنجش فعالیت آنزیمی لیپاز 27
3-2-4- نرم افزارها 27
3-3- روش­ها 28
3-3-1- روش تهیه مایعات یونی 28
3-3-1-1- روش تهیه مایعات یونی با آنیون برمید 28
3-3-1-2- روش تهیه مایعات یونی با آنیون هگزافلوروفسفات 28
3-3-2- روش کشت باکتری و بیان القایی پروتئین نو ترکیب 29
3-3-2-1- محیط کشت باکتری E. coli 29
3-3-2-2- انتقال DNA خارجی به باکتری E.coli 29
3-3-2-2-1-  تهیه سلول های مستعد به روش شیمیایی 29
3-3-2-2-2- انتقال پلاسمید به سلول مستعد 30
3-3-2-3- روش تهیه استوک باکتری 31
3-3-2-4- کشت باکتری و القای بیان آنزیم نوترکیب 31
3-3-2-5- بهینه سازی بیان آنزیم نوترکیب 31
3-3-2-5- 1- انتخاب بهترین کلنی از نظر بیان آنزیم TTL 31
3-3-2-5-2- انتخاب بهترین زمان پس از القا 32
3-3-2-6- استخراج عصاره سلولی حاوی لیپاز TTL 32
3-3-3- روش تخلیص آنزیم لیپاز TTL 33
3-3-3-1- روش رسوب دهی دمایی 33
3-3-3-1-1- بهینه سازی رسوب دهی دمایی 33
3-3-3-2- روش تخلیص به کمک ستون کروماتوگرافی 33
3-3-4- روش سنجش کمی پروتئین 34
3-3-4-1- سنجش کمی میزان پروتئین به روش برادفورد 34
3-3-4-2- سنجش کمی میزان پروتئین به روش جذب nm 280 34
 

عنوان

صفحه
3-3-5- الکتروفورز ژل پلی­آکریل آمید با SDS (SDS-PAGE) 35
3-3-5-1- آماده سازی محلول­های الکتروفور 35
3-3-5-2- آماده سازی سیستم الکتروفورز 36
3-3-6- سنجش فعالیت آنزیمی با سوبسترای پارانیتروفنیل پالمیتات 38
3-3-7- روش بررسی فعالیت آنزیمی در حضور غلظت های مختلف از انواع مایعات یونی 39
3-3-8- روش بررسی پایداری دمایی آنزیم TTL در دماهای بالا 39
3-3-9- روش بررسی پایداری آنزیم لیپاز TTL در حضور مایعات یونی مختلف 39
3-3-10- روش بررسی ساختار سوم آنزیم TTL در حضور مایعات یونی 40
فصل چهارم: نتایج

 

 

 

4-1- بهینه سازی بیان آنزیم نوترکیب 42
4-1-1- انتخاب بهترین کلنی از نظر بیان آنزیم TTL 43
4-1-2- بهینه سازی زمان پس از القا 43
4-2- تخلیص آنزیم لیپاز TTL 44
4-2-1- بهینه سازی تخلیص نسبی به روش رسوب دهی دمایی 44
4-2-2- تخلیص به کمک ستون کروماتوگرافی Q- سفاروز 45
4-3- سنتز مایعات یونی 47
4-4- اثر مایعات یونی بر فعالیت هیدرولازی آنزیم TTL 47
4-5- اثر مایعات یونی بر پایداری دمایی آنزیم TTL 48
4-5-1- پایداری دمایی TTL در عدم حضور مایعات یونی 48
4-5-2- پایداری دمایی آنزیم TTL در حضور مایعات یونی 49
4-5-2-1- بررسی پایداری TTL در [C4MIM][Br] و ] [C4MIM][PF6 در دماهای مختلف 49
4-5-2-2- مقایسه اثر نوع آنیون مایعات یونی بر پایداری دمایی 51
4-5-2-3- مقایسه اثر نوع کاتیون و طول­های مختلف زنجیره کربنی مایعات یونی بر پایداری دمایی آنزیم 51
4-6- بررسی ساختار سوم آنزیم در حضور و عدم حضور مایعات یونی 54
فصل پنجم: بحث

 

 

 

5-1- اثر مایعات یونی بر فعالیت هیدرولازی آنزیم TTL 57
 

عنوان

صفحه
5-2- اثر مایعات یونی بر پایداری دمایی آنزیم TTL 59
5-3- بررسی ساختار سوم آنزیم در حضور مایعات یونی 61
فصل ششم: نتیجه­گیری و پیشنهادات

 

 

 

6-1- نتیجه­گیری 63
6-2- پیشنهادات 63
فهرست منابع 65
چکیده انگلیسی 75

فهرست جدول­ها

 

 

عنوان

 

صفحه

 

جدول1-1- میکروارگانیسم­های تولید کننده لیپاز 4
جدول2-1- آنیون­های متداول در مایعات یونی 19
جدول 3-1- محیط کشت Luria Bertani 29
جدول 3-2- نحوه تهیه محلول TSB 30
جدول 3-3- نحوه تهیه محلول KCM 31
جدول 3-4- نحوه تهیه محلول برادفورد 34
جدول 3-5-  نحوه تهیه بافر نمونه 4X 37
جدول 3-6- نحوه تهیه ژل پلی اکریل آمید 37
جدول 3-7- نحوه تهیه مخلوط سنجش فعالیت آنزیم 38
جدول 4-1- فعالیت­های لیپازی عصاره­های سلولی کلنی­های 1 تا 6 حاصل از ترانسفورماسیون 44
جدول 4-2- مشخصات مراحل تخلیص TTL. 46
جدول 5-1- غلظت­های بهینه مایعات یونی (CnMIM Br n=2,4,6) و CMC های مربوطه 58

فهرست شکل­ها

 

 

عنوان

 

صفحه

 

شکل 1-1- آنزیم لیپاز ریزوموکور میهی (PDB entry 3TGL) 6
شکل 1-2- آنیون­ها و کاتیون­های مرسوم در مایعات یونی مورد استفاده در بیوکاتالیز 9
شکل 1-3- آنزیم CALB در حضور مایعات یونی بدون آب 12
شکل2-1- ساختارهای نمونه از کاتیون مایعات یونی معمول در بیوکاتالیز 18
شکل 3-1- سنتز مایعات یونی با آنیون برمید 28
شکل 4-1- وکتور PQE-80L حاوی ژن آنزیم TTL 42
شکل 4-2- بهینه سازی مدت زمان تخلیص به روش رسوب دهی دمایی 45
شکل 4-3- کروماتوگرام ستون Q- سفاروز؛ تخلیص آنزیم TTL 46
شکل 4-4- تصویر ژل SDS-PAGE 5/12 % از مراحل تخلیص آنزیم TTL 47
شکل 4-5- اثر غلظت­های مختلف مایعات یونی بر فعالیت آنزیمی 48
شکل 4-6- نمودار پایداری آنزیم TTL در دماهای بالا در بافر تریس mM 50 49
شکل4-7- نمودار پایداری TTL در [C4MIM][Br] و [C4MIM][PF6] در دماهای °C 85 و °C90 50
شکل4-8- نمودار پایداری دمایی TTL در مایعات یونی؛ مقایسه اثر نوع آنیون 52
شکل 4-9-  نمودار مقایسه اثر مایعات یونی با طول­های مختلف زنجیره کربنی کاتیون ایمیدازولیوم بر پایداری دمایی آنزیم TTL 53
شکل 4-10- نمودار بررسی اثر نوع کاتیون بر پایداری دمایی آنزیم TTL 53
شکل 4-11- طیف فلورسانس آنزیم TTL در بافر تریس mM 50 پس از حرارت­دهی در °C 85 54
شکل 4-12- طیف­های فلورسانس مربوط به آنزیم TTL انکوبه شده در مایعات یونی ایمیدازولیومی با آنیون PF6 55
شکل 4-13- طیف فلورسانس آنزیم TTL انکوبه شده در مایع یونی [C4MIM][PF6] 55

مقدمه

 

 

1-1- آنزیم­ها

آنزیم ها کاتالیزورهای زیستی بسیار کارآ هستند که می­توانند سرعت واکنش­ها را تا 17 برابر افزایش دهند(Agarwal, 2006). بخشی از زیست توده[1] زمین لیپیدها هستند و آنزیم­های لیپولیتیک[2] نقش مهمی در حذف این مواد نامحلول در آب را دارند. آنزیم­های لیپولیتیک در شکستن و حرکت دادن لیپیدها درون سلول­های یک جاندار و انتقال لیپیدها از یک جاندار به جاندار دیگر نقش دارند (Beisson et al., 2000).

آنزیم­ها مزایای زیادی در انجام واکنش­ها دارند که از جمله آن­ها می­توان اختصاصیت بالای آن­ها، انجام واکنش در شرایط معتدل، کاهش مواد زائد، تعیین نوع محصول و کاهش محصولات جانبی با انتخاب آنزیم مناسب، کاهش هزینه­ها و سرمایه لازم در مقیاس بزرگ، کاهش اتلاف هزینه در فرآیندهای آنزیمی، زیست تخریب پذیر بودن آنزیم­ها، کاهش میزان مصرف کاتالیزور (آنزیم) به میزان 1%- 1/0% سوبسترا را نام برد؛ بنابراین سهم آنزیم در[3]BOD جریان مواد زائد بسیار ناچیز است (Posorske et al., 1984).

آنزیم­های میکروبی کارآتر از انواع گیاهی و جانوری هستند. آنزیم­های میکروبی دارای تنوع عملکردی بالا، بازده بالا، دست­ورزی ژنتیکی آسان، منبع مشخص (که این به دلیل نبود نوسانات فصلی، رشد سریع باکتری و محیط رشد ارزان قیمت آن می­باشد)، پایداری بیش­تر و تولید آسان­تر نسبت به انواع گیاهی و جانوری هستند (Wiseman et al., 1995). رشد سریع باکتری­ها و بنابراین آسان­تر بودن فرآیندهای غربالگری در مورد آن­ها، باعث تسهیل فرآیندهایی هم­چون دست ورزی ژنتیکی و ایجاد تغییرات در محیط اطراف سلول، در جهت دست­یابی به بیش­ترین تولید آنزیم، افزایش فعالیت آنزیمی سلول­ها، ایجاد روند تولید پیوسته یا تولید القایی می­شوند. تنها حدود دو درصد از گونه­های میکروبی به عنوان منبع آنزیم بررسی شده ­اند که در این میان سویه های باکتریایی به دلیل فعالیت بالاتر، pH بهینه خنثی یا قلیایی و مقاومت به دما، بیش­تر از مخمرها مورد استفاده قرار گرفته­اند (Frost and Moss, 1987).

 

تعداد صفحه : 94

قیمت : 14700 تومان

بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد

و در ضمن فایل خریداری شده به ایمیل شما ارسال می شود.

پشتیبانی سایت :        ****       [email protected]

در صورتی که مشکلی با پرداخت آنلاین دارید می توانید مبلغ مورد نظر برای هر فایل را کارت به کارت کرده و فایل درخواستی و اطلاعات واریز را به ایمیل ما ارسال کنید تا فایل را از طریق ایمیل دریافت کنید.

***  *** ***

دسته‌ها: زیست شناسی